In den späten 1980er Jahren, als die konfokale Lasermikroskopie jedoch weiterentwickelt wurde, weist sie einen großen Mangel auf: Die konfokale Apertur blockiert nicht nur die außerhalb des Brennpunkts erzeugte Fluoreszenz, sondern blockiert auch die vom Brennpunkt erzeugte Fluoreszenz, die durch das biologische Gewebe gestreut wird. Dies führt zu einer Verringerung der Sammeleffizienz der Fluoreszenz und die Bildtiefe darf nicht mehr als 100 Mikrometer betragen. Daher entstand in den 1990er Jahren die Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie, die Laser-Konfokalmikroskopie und Zwei-Photonen-Anregungstechnologie kombiniert. Die Anregungswellenlänge des Zwei-Photonen-Absorptionsprozesses wird im Allgemeinen im biooptischen Fensterbereich von 680-1080 nm eingestellt, wodurch die Schädigung der Zellen oder lebenden Organismen durch ultraviolettes Licht vermieden wird und tiefer eindringt.
Das derzeit am weitesten verbreitete Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskop ist der Femtosekunden-Titan-Edelsteinlaser, der sperrig und teuer ist, was die Anwendung der Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie in verschiedenen Bereichen wie Biowissenschaften, Chemie und Medizin einschränkt. Daher hat man in einigen Bereichen wie der medizinischen Diagnostik versucht, kompakte und erschwingliche Sub-Nanosekunden-Festkörperlaser als Standardlichtquelle zu verwenden.
Das Grundprinzip der Zwei-Photonen-Anregung besteht darin, dass ein fluoreszierendes Molekül bei Anregung mit hoher Photonendichte gleichzeitig zwei langwellige Photonen absorbiert und dann nach Anregungssprüngen und Relaxationsprozessen spontan fluoreszierende Photonen zurück in den Grundzustand abstrahlt. Im Vergleich zur herkömmlichen Einzelphotonen-Anregungs-Fluoreszenzmikroskopie ist die optische Signalerzeugung bei der Zwei-Photonen-Anregungs-Fluoreszenzmikroskopie nichtlinear, da das Anregungslicht eine Lichtquelle mit längerer Wellenlänge und höherer Spitzenleistung ist und die emittierten Fluoreszenzphotonen eine Wellenlänge haben etwas länger als die Hälfte der Anregungswellenlänge.
Die Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie verwendet eine Laserlichtquelle im nahen Infrarot und erfordert aufgrund ihrer nichtlinearen Natur keine konfokale Apertur. Daher hat die Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie gegenüber der konfokalen Mikroskopie folgende Vorteile:
- Große Abbildungstiefe und geringer optischer Schaden;
- Es ist keine konfokale Apertur erforderlich und die Effizienz der Fluoreszenzsammlung wird erheblich verbessert;
- Höhere räumliche Auflösung und höherer Kontrast;
- Kleiner Anregungsbereich, geringe Phototoxizität und Bleichung;
- Die Emissions- und Anregungswellenlängen liegen weit auseinander, wodurch spektrale Überlappungen vermieden werden.
